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當(dāng)前位置:首頁(yè) > 科研服務(wù) > 蛋白/核酸相互作用 > 蛋白-蛋白互作 > SILAC-IP免疫共沉淀
實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介買(mǎi)此服務(wù)

SILAC-IP * 實(shí)驗(yàn)原理


用SILAC結(jié)合免疫共沉淀(CoIP)尋找相互作用蛋白是SILAC在定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究基礎(chǔ)上的進(jìn)一步應(yīng)用,稱(chēng)之為SILAC-IP技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)質(zhì)譜鑒定和分析蛋白質(zhì)相對(duì)量來(lái)判斷是否是特異性結(jié)合誘餌蛋白,當(dāng)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中某個(gè)蛋白質(zhì)量含量達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異時(shí),就判定這個(gè)蛋白質(zhì)與誘餌蛋白質(zhì)具有相互作用。SILAC技術(shù)是先將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的蛋白帶上不同的同位素,即重鏈、輕鏈氨基酸蛋白。復(fù)合物分離后,混在同一管中做酶切質(zhì)譜等。這樣既能鑒定到復(fù)合物蛋白,又能根據(jù)同位素峰強(qiáng)度判斷誘餌蛋白組和對(duì)照組中蛋白的相對(duì)含量,從而更準(zhǔn)確地判斷出互作蛋白。





SILAC-IP * 實(shí)驗(yàn)方案



不同的實(shí)驗(yàn)背景和目的需對(duì)應(yīng)用不同方案,輝駿生物提供以下三種SILAC-IP實(shí)驗(yàn)方案:



方案一:以野生型細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)材料


1.分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)細(xì)胞,取等量標(biāo)記好的細(xì)胞提取蛋白質(zhì);
2.提取的輕鏈、重鏈細(xì)胞總蛋白分別用Normal IgG和抗bait蛋白的特異抗體做Co-IP;
3.混合輕、重鏈Co-IP產(chǎn)物;
4.胰酶酶切,LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。


SILAC免疫共沉淀技術(shù)服務(wù)_SILAC-IP_silac ip實(shí)驗(yàn)外包公司.jpg


方案二:以過(guò)表達(dá)誘餌蛋白的細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)材料


1. 分別用輕、重鏈氨基酸培養(yǎng)正常對(duì)照細(xì)胞和過(guò)表達(dá)誘餌蛋白的細(xì)胞株(帶標(biāo)簽),取等量標(biāo)記好的細(xì)胞分別提取蛋白質(zhì),并再次定量;
2. 取等量蛋白混合,用誘餌蛋白抗體做Co-IP;
3. 收集Co-IP后的蛋白液,胰酶酶切,LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。

SILAC IP代做_silac ip外包平臺(tái).jpg



方案三:以干擾誘餌蛋白的細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)材料


1. 分別用輕鏈、重鏈氨基酸培養(yǎng)RNAi 誘餌蛋白的細(xì)胞株和正常對(duì)照細(xì)胞株,取等量標(biāo)記好的細(xì)胞分別提取蛋白質(zhì),并再次定量;
2. 取等量蛋白混合,用誘餌蛋白抗體做Co-IP;
3. 收集Co-IP后的蛋白液,胰酶酶切,LC-MS/MS鑒定和定量蛋白。

SILAC-IP外包實(shí)驗(yàn),silac ip技術(shù)服務(wù),silac ip檢測(cè)實(shí)驗(yàn).jpg



SILAC-IP * 應(yīng)用背景


免疫共沉淀(Co-IP)在分離純化蛋白復(fù)合物過(guò)程中,不可避免地會(huì)出現(xiàn)非特異結(jié)合蛋白,這些蛋白會(huì)一并被質(zhì)譜鑒定出來(lái),成為假陽(yáng)性的互作蛋白,影響后續(xù)挑選驗(yàn)證。 傳統(tǒng)的判斷假陽(yáng)性互作蛋白方法是:用誘餌蛋白組鑒定到的蛋白列表,扣除掉對(duì)照組鑒定到的蛋白列表,作為“互作蛋白”。但很多真實(shí)的互作蛋白,比如豐度比較高的蛋白,在對(duì)照組中也會(huì)出現(xiàn),而傳統(tǒng)的方法就會(huì)被排除掉。SILAC-IP技術(shù)將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的蛋白帶上不同的同位素,結(jié)合質(zhì)譜分析,既能鑒定到復(fù)合物蛋白,又能根據(jù)同位素峰強(qiáng)度判斷誘餌蛋白組和對(duì)照組中蛋白的相對(duì)含量,從而更準(zhǔn)確地判斷出互作蛋白。

相較于傳統(tǒng)的免疫共沉淀和pull down技術(shù),SILAC-IP技術(shù)特異性強(qiáng),假陽(yáng)性極低,通量高,靈敏度高,能直接檢測(cè)出與bait蛋白互作的其他蛋白的相對(duì)含量;適合于可傳代細(xì)胞,尤其是易轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。


添加技術(shù)員微信溝通實(shí)驗(yàn)
18927549347



SILAC-IP * 輝駿服務(wù)內(nèi)容


SILAC-IP(SILAC標(biāo)記的免疫共沉淀)檢測(cè)服務(wù)
服務(wù)項(xiàng)目服務(wù)內(nèi)容結(jié)果交付實(shí)驗(yàn)周期客戶(hù)提供價(jià)格
SILAC-IPCo-IP預(yù)實(shí)驗(yàn)input和CoIP產(chǎn)物的Western blot檢測(cè)圖
2-3周

未標(biāo)記的待測(cè)細(xì)胞

SILAC標(biāo)記完全的待測(cè)細(xì)胞

誘餌蛋白的IP級(jí)抗體

實(shí)驗(yàn)信息表(樣本信息、抗體信息、誘餌蛋白序列)


點(diǎn)擊詢(xún)價(jià)




 


SILAC標(biāo)記效率檢測(cè)

標(biāo)記效率檢測(cè)表

標(biāo)記效率檢測(cè)報(bào)告

2-3周
Western blot檢測(cè)SILAC標(biāo)記細(xì)胞(input)中的誘餌蛋白Western blot檢測(cè)圖7-8周
CoIP實(shí)驗(yàn)調(diào)取誘餌蛋白及其互作蛋白

Western blot檢測(cè)圖

CoIP實(shí)驗(yàn)報(bào)告

IP產(chǎn)物的SILAC蛋白定量檢測(cè)和分析

質(zhì)譜檢索表

互作蛋白篩選表

互作蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果

SILAC檢測(cè)和分析報(bào)告





SILAC-IP * 結(jié)果示例



圖片.png

silac ip:質(zhì)譜檢索表格(部分展示)




SILAC-IP  * 客戶(hù)文獻(xiàn)


1. Chen Y.J. et al: Identification of Novel SCIRR69-Interacting Proteins During ER Stress Using SILAC-Immunoprecipitation Quantitative Proteomics Approach. Neuromolecular Med. 2017,IF=2.629.

【研究?jī)?nèi)容】:為了更好地研究CREB/ATF家族成員SCIRR69在ER應(yīng)激過(guò)程中的功能作用,研究者首先用ER應(yīng)激激活劑(TG)和衣霉素(TM)處理了SCN和PC12細(xì)胞,,qRT-PCR和western結(jié)果顯示SCIRR69可能在ER應(yīng)激中起重要作用。采用SILAC IP方法篩選出ER過(guò)程中SCIRR69的相互作用蛋白TERA和SFXN1,并通過(guò)Co-IP技術(shù)驗(yàn)證了它們與SCIRR69的相互作用。研究結(jié)果有助于更好地理解SCIRR69在ER應(yīng)激中的基本功能。

使用相關(guān)技術(shù):silac ip檢測(cè)、silac ip服務(wù)、SILAC IP免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)服務(wù)


2. Edward. E. et al Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics. Journal of Visualized Experiments.  2014,IF=1.163.

【研究?jī)?nèi)容】:每個(gè)骨髓瘤患者都有多個(gè)亞克隆,具有高或低染色體不穩(wěn)定性(CIN)特征的多個(gè)亞克隆共存會(huì)導(dǎo)致異質(zhì)性和耐藥性,導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。作者通過(guò)串聯(lián)親和純化質(zhì)譜(TAP-MS)技術(shù),發(fā)現(xiàn)了CIN基因NEK2與脫泛素酶USP7結(jié)合。該結(jié)合阻止了NEK2泛素化并使其穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn),使用NEK2或USP7抑制劑進(jìn)行靶向治療可能是骨髓瘤最有效的輔助治療方法。

使用相關(guān)技術(shù):silac ip技術(shù)、silac ip免疫共沉淀、SILAC-IP質(zhì)譜





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? COIP 試劑盒

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輝駿實(shí)力

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4899+客戶(hù)已添加微信獲取實(shí)驗(yàn)優(yōu)惠!


SILAC-IP(SILAC標(biāo)記的免疫共沉淀)服務(wù)介紹


SILAC-IP是在SILAC標(biāo)記細(xì)胞中進(jìn)行Co-IP(免疫共沉淀)的技術(shù)。


SILAC-IP(SILAC標(biāo)記的免疫共沉淀)檢測(cè)服務(wù)
服務(wù)項(xiàng)目服務(wù)內(nèi)容結(jié)果交付實(shí)驗(yàn)周期客戶(hù)提供價(jià)格
SILAC-IPCo-IP預(yù)實(shí)驗(yàn)確定抗體拉取效果input和CoIP產(chǎn)物Western blot檢測(cè)圖
2-3周

待測(cè)細(xì)胞及其培養(yǎng)方法

誘餌蛋白的IP級(jí)抗體

實(shí)驗(yàn)信息表(樣本信息、抗體信息、誘餌蛋白序列)


點(diǎn)擊詢(xún)價(jià)




 


Western blot檢測(cè)SILAC標(biāo)記細(xì)胞(input)中的誘餌蛋白Western blot檢測(cè)圖7-8周
CoIP實(shí)驗(yàn)調(diào)取誘餌蛋白及其互作蛋白

Western blot檢測(cè)圖

SILAC蛋白定量檢測(cè)Co-IP產(chǎn)物的蛋白、篩選誘餌蛋白的互作蛋白

質(zhì)譜檢索表

互作蛋白篩選表格

SILAC-IP實(shí)驗(yàn)報(bào)告

針對(duì)互作蛋白做生物信息學(xué)分析(GO、KEGG pathway、String)生物信息學(xué)分析結(jié)果和報(bào)告1周


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SILAC IP實(shí)驗(yàn)服務(wù)*輝駿優(yōu)勢(shì)

1

近十年服務(wù)經(jīng)驗(yàn),眾多服務(wù)案例,服務(wù)成果得到優(yōu)秀期刊認(rèn)可。

2

對(duì)蛋白互作的篩選鑒定理解深刻,擅長(zhǎng)針對(duì)客戶(hù)情況提出合適的方案建議。

3

自有分子及細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)平臺(tái),能有效制定并執(zhí)行最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)路線。

4

自有蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái),對(duì)微量互作蛋白的質(zhì)譜鑒定有十足的把控能力,對(duì)后續(xù)的生物信息分析有獨(dú)到的見(jiàn)解。

5

售后技術(shù)支持將一直保持到客戶(hù)發(fā)表文章,確??蛻?hù)安心進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)及投稿。





SILAC標(biāo)記的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)樣本要求


1. 送樣要求

樣本類(lèi)型
建議送樣量
待測(cè)細(xì)胞

(廣州市內(nèi)客戶(hù))可接受活細(xì)胞,2個(gè)T25瓶,細(xì)胞匯合度>80%;

(其他地區(qū)客戶(hù))凍存細(xì)胞2管。


2. 樣本保存和運(yùn)輸要求:

(1)活細(xì)胞常溫取樣;

(2)凍存細(xì)胞干冰取樣/運(yùn)輸:需要至少在送樣前一天通知我方。





silac-ip技術(shù)服務(wù)結(jié)果示例


圖片.png

silac ip:質(zhì)譜檢索表格(部分展示)





免疫共沉淀SILAC-IP 客戶(hù)文獻(xiàn)


1. Chen Y.J. et al: Identification of Novel SCIRR69-Interacting Proteins During ER Stress Using SILAC-Immunoprecipitation Quantitative Proteomics Approach. Neuromolecular Med. 2017,IF=2.629.

【研究?jī)?nèi)容】:為了更好地研究CREB/ATF家族成員SCIRR69在ER應(yīng)激過(guò)程中的功能作用,研究者首先用ER應(yīng)激激活劑(TG)和衣霉素(TM)處理了SCN和PC12細(xì)胞,,qRT-PCR和western結(jié)果顯示SCIRR69可能在ER應(yīng)激中起重要作用。采用SILAC IP方法篩選出ER過(guò)程中SCIRR69的相互作用蛋白TERA和SFXN1,并通過(guò)Co-IP技術(shù)驗(yàn)證了它們與SCIRR69的相互作用。研究結(jié)果有助于更好地理解SCIRR69在ER應(yīng)激中的基本功能。

使用相關(guān)技術(shù):silac ip檢測(cè)、silac ip服務(wù)、SILAC IP免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)服務(wù)


2. Edward. E. et al Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics. Journal of Visualized Experiments.  2014,IF=1.163.

【研究?jī)?nèi)容】:每個(gè)骨髓瘤患者都有多個(gè)亞克隆,具有高或低染色體不穩(wěn)定性(CIN)特征的多個(gè)亞克隆共存會(huì)導(dǎo)致異質(zhì)性和耐藥性,導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)。作者通過(guò)串聯(lián)親和純化質(zhì)譜(TAP-MS)技術(shù),發(fā)現(xiàn)了CIN基因NEK2與脫泛素酶USP7結(jié)合。該結(jié)合阻止了NEK2泛素化并使其穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn),使用NEK2或USP7抑制劑進(jìn)行靶向治療可能是骨髓瘤最有效的輔助治療方法。

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