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肝臟是人體內最大的器官，在營養(yǎng)和能量代謝方面起著至關重要的作用。肝臟代謝紊亂將導致Ⅱ型糖尿病、血脂異常和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的產生。非酒精性脂肪肝炎（NASH）是NAFLD最極端的形式，也是肝硬化和肝細胞癌等終末期肝病的主要病因。

以往的研究發(fā)現肝內存在多種受體配體信號轉導方式，且這種信號通訊在維持肝內組織穩(wěn)態(tài)及肝損傷反應過程起到重要作用。盡管如此，單細胞水平下的細胞間通訊圖譜及NASH發(fā)病過程中肝細胞的異質性特點仍未被闡明。

本研究通過單細胞轉錄組測序鑒定得到健康和NASH小鼠肝臟非實質細胞（NPC）細胞圖譜，解析了在NASH過程中肝細胞間受體配體相互作用，并發(fā)現一種NASH相關的巨噬細胞，可能作為NASH治療的良好靶標。

1. 肝臟NPC的單細胞圖譜

為了探究NASH的發(fā)病機制，作者首先對健康和NASH小鼠的肝臟進行了常規(guī)轉錄組測序，與健康組相比，共篩選到772個差異基因，包括311個下調基因和461個上調基因（Fig. 1A-C）。對這些差異基因進行GO富集分析，發(fā)現下調基因主要富集在脂質代謝和氧化反應相關的GO條目；上調的基因則富集到細胞外基質、細胞粘附、吞噬和免疫反應等GO條目，而這些功能主要由肝臟中的非實質細胞（NPC）承擔，表明在NASH發(fā)病機制中，NPC可能承擔著較為重要的作用。因此作者從肝臟中分離了NPC進行單細胞轉錄組測序，以探究肝臟中NPC的異質性特點及其在NASH發(fā)病過程中的作用。

對健康和NASH小鼠肝臟NPC進行單細胞轉錄組測序分析，共獲得33,168個細胞，鑒定到內皮細胞、巨噬細胞、T細胞等10種細胞類型(Fig1D-1F)，這些細胞類型在小鼠和人類之間表現出高度保守的轉錄特征(Fig. 1G)。將RNA-seq與scRNA-seq的結果聯合分析，發(fā)現由NASH誘導上調的基因主要分布在巨噬細胞和肝星狀細胞（HSC）中，NASH肝臟中下調的基因分布在肝實質細胞中(Fig. 1I)。

Fig. 1健康和NASH小鼠肝臟NPCs的scRNA-Seq分析

2. 單細胞水平的分泌因子與受體相互作用分析

單細胞轉錄組測序得到305個分泌因子與147個膜受體, 這些分泌因子與受體基因在不同的細胞類型中特異性表達，且表達模式在人和小鼠間高度保守（Fig.2A-C）。作者在此基礎上構建了肝臟不同細胞間信號傳遞的高分辨圖譜，其中HSCs、內皮細胞和巨噬細胞是旁分泌和自分泌信號的重要中心(Fig. 2D)。

Fig. 2 肝細胞分泌基因分析

3. 內皮細胞的血管信號傳導功能

內皮細胞是NPC中最大的細胞群，共10,447個細胞，將內皮細胞進行二次聚類可得到4個亞群，分別為門靜脈周圍(Endo-pp)內皮細胞、中心周圍(Endo-PC)內皮細胞，以及兩個肝竇內皮細胞簇(LSEC-1和LSEC-2)，這些亞群獨特的轉錄特征使它們能夠在肝臟內不同的區(qū)域發(fā)揮不同的功能(Fig. 3A-C)。

為了探究NASH對內皮細胞功能的影響，作者結合scRNA-seq及內皮轉錄組測序結果，發(fā)現來源于NASH肝的內皮細胞表現出與脂質代謝、抗原呈遞和趨化因子釋放相關的基因表達量增加，而與血管發(fā)育和體內穩(wěn)態(tài)有關的基因顯著下調，對此作者通過流式細胞術和免疫熒光驗證對上述結論進行了驗證（Fig. 3E,F），并推測由于內皮細胞轉錄組的重編程導致了NASH期間竇狀毛細血管的嚴重損傷。同時，在NASH樣本中內皮細胞的膜受體及血管分泌因子（配體）的mRNA顯著下調（Fig. 3H）表明在NASH期間血管和血管分泌素信號傳導存在嚴重中斷，并且這種中斷也同時發(fā)生在人類NASH患者中(Fig. 3I)。

Fig. 3 內皮細胞亞群分析

4. NASH相關巨噬細胞的出現及其分子標記

通過分析健康和NASH來源的巨噬細胞數目，發(fā)現NASH組的巨噬細胞顯著增多（Fig. 4A），對這些巨噬細胞進行亞型分析，可分為庫普弗細胞（Kupffer cells，KCs）和單核細胞來源的巨噬細胞 (MDMs) (Fig. 4A.B)。為了探究NASH如何改變巨噬細胞的功能特性，作者開發(fā)了一種通過基因表達特征來定量評估巨噬細胞極化水平的算法，巨噬細胞極化指數(MPI)越高，炎癥表型越顯著，通過這一分析證實了NASH會誘導巨噬細胞向促炎表型轉變（Fig. 4C），這與NASH疾病進程中的促炎環(huán)境相吻合。

接下來作者進一步分析了巨噬細胞的亞型特點，通過Trem2的表達可將KCs分為Trem2lo和Trem2hi兩群（Fig. 4D），由于超過93%的Trem2hi來源于NASH，因此把這群細胞命名為NASH相關的巨噬細胞“NASH-associated macrophages”(NAMs)。另外，NAMs還高表達Gpnmb 和Cd9，這些基因可作為NASH的生物標記物。

Fig. 4 NASH相關巨噬細胞的鑒定

5. 肝星狀細胞的受體配體信號網絡

該研究另一項重要的發(fā)現是肝星狀細胞活躍的信號傳遞功能。通過單細胞轉錄組測序共獲得272個肝星狀細胞（HSC），HSC的分泌組十分豐富，包含了多個編碼膜蛋白和分泌因子的基因，作者選取了表達較活躍的分泌組基因構建了配體-受體信號網絡，并將這一群獨特的分泌因子命名為“Stellakines”，從網絡圖中可以看出這些Stellakines作用的主要細胞靶點是內皮細胞和免疫細胞（Fig. 5B）。同時，肝星狀細胞表面還富集了多種受體，使其能夠對不同的細胞外信號作出反應，起到肝內信號傳遞樞紐的作用(Fig. 5D)。

最后作者對肝星狀細胞中的血管活性激素信號傳導通路進行分析，并證實Stellakines的表達受到IL11自分泌信號的調控。雖然沒有明確IL11的病理作用，但指出Stellakines的分泌失調是NASH進程中肝星狀細胞的一個重要生物學特點。

Fig. 5 HSC信號轉導網絡

研究結論

本研究基于scRNA-seq測序，單細胞分辨率下繪制了主要的肝細胞群體中分泌配體和膜受體的轉錄圖譜，并構建了配體-受體信號網絡，為解構穩(wěn)態(tài)和疾病中細胞間通訊的動態(tài)性質提供了藍圖。

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