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轉錄組測序 對研究人員很重要，因為它們幫助我們了解細胞機器如何解釋基因組序列以及這些序列的改變。 它們對于許多功能分析也是必要的。 如果沒有適當?shù)霓D錄組注釋，就不可能進行 RNA-seq 研究來探索差異基因表達或預測組織或生物體中存在哪些蛋白質(zhì)。

現(xiàn)在測序技術已經(jīng)發(fā)展到可以很快以比以前更低的成本為更廣泛的生物（包括單細胞真核生物）生成高質(zhì)量的基因組參考和轉錄組注釋的地步。雖然基因組將很快組裝成具有合理可靠性的染色體規(guī)模支架，但技術限制阻止轉錄組注釋技術識別從這些染色體表達的基因和同種型。

現(xiàn)在可以使用短讀長測序、鏈接短讀長測序、長讀長測序和光學作圖等技術的組合來構建高質(zhì)量的“著絲粒到端?！被蚪M序列?；蚪M組裝現(xiàn)在正進入黃金時代。從單細胞真核生物到北極熊的非模式生物將從這些強大且相對便宜的方法中受益匪淺，而這些方法以前缺乏以艱難的方式生成高質(zhì)量基因組參考所需的注意力和大筆資金——染色體圖譜、桑格測序細菌人工染色體文庫等。

大多數(shù)基因組組裝突破不適用于轉錄組注釋。短讀長和長讀長測序技術現(xiàn)在用于轉錄組注釋，但是，它們都存在缺陷，使得實現(xiàn)“參考級”轉錄組注釋既耗時又困難。

異構體的全長轉錄組測序工作流程

300 ng 總 RNA 用于異構體測序。選擇 poly-A RNA 后，將其轉化為 cDNA，為文庫組裝做準備。此外，最多可對 12 個樣品進行多重分析，以實現(xiàn)一種簡化且經(jīng)濟高效的方法。

獲得測序數(shù)據(jù)后，選擇兩側有 cDNA 引物和 poly-A 尾的讀數(shù)作為全長讀數(shù)。然后可以按轉錄本異構體對讀數(shù)進行分組，以產(chǎn)生獨特的共識。

然后可以將異構體映射到參考基因組，并且可以使用 SQANTI 和 Maker 等工具以基于參考的方式注釋異構體。PacBio 的 Iso-Seq 分析采用一鍵式生物信息學程序來處理同種型數(shù)據(jù)，而無需參考基因組或從頭方法注釋。

全長轉錄本測序的應用

基因組注釋是的首次應用全長轉錄序列。這在植物和動物科學中特別有用，其中基因組通常比人類基因組復雜得多，并且參考質(zhì)量的基因組組裝可能仍然非常昂貴。

全長轉錄本還有助于表征以前由于片段重復而難以識別的人類基因。研究人員觀察了在大腦中表達的具有長片段重復的 19 個基因家族，發(fā)現(xiàn)由于新的轉錄起始、剪接和聚腺苷酸化位點，近一半的表達基因重復與其祖先模型發(fā)生了顯著變化。

其他人已經(jīng)采用全長 RNA 測序以類似的方式分析可變剪接和多聚腺苷酸化譜，但這次是在物種之間。